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【科研進展】先進院科研攻關,讓蛋白質結晶技術從難到簡

時間:2020-12-10        來源:

第六期科普時,我們已經介紹了蛋白質晶體。

查看蛋白質晶體科普——【趣味科普】第六期:為抗擊疫情立下大功的蛋白質晶體,到底是什么?

大尺寸SARS-CoV-2蛋白酶(3CL M)晶體,大約2×0.8×0.2?mm,0.3?mm3,用于中子和X射線衍射數據收集。

 

01

讓蛋白質結晶意義重大

對“靜止”的蛋白質進行觀察,很多“疑難雜癥”都能浮出水面,蛋白質晶體對于生命科學的研究具有重大意義。以今年年初爆發的新型冠狀病毒(2019-nCoV)為例,我國科學家就是利用病毒的水解酶與抑制劑的復合物晶體成功解析了原子結構,可為抗病毒藥物的快速篩選和研發提供有力的工具。截止2020年1月1日,蛋白質數據庫收錄了超過16萬個蛋白質晶體的原子結構信息,已經滲透到了眾多領域,如藥學,醫學,農業,材料學等。目前,有9位科學家因解析蛋白質的晶體結構而獲得諾貝爾獎。然而,讓蛋白質結晶可不是一件容易的事情。

在太空中生長的人胰島素晶體

 

在科學界,蛋白質晶體的生長常常被認為是“藝術”遠多于“科學”,甚至有許多科學家為了晶體更好地結晶,開始有些“小迷信”:比如把做好的結晶板放在車上開出去幾個小時,或是在晶體實驗柜門上貼了兩只大恐龍貼紙……。其實,這些“小迷信”都反映出:蛋白質晶體的結晶過程受到很多因素的影響,能夠有一顆完整的結晶是一件很困難的事情。想要獲得足夠質量的晶體,尤其對新穎的、表征不佳的基因產物來說,通常是新結構測定項目中最困難也是最耗時的步驟。

02

蛋白質結晶技術發展的艱難歷程

科學家們研究蛋白質結晶技術花費了很長時間。1988年諾貝爾化學獎被授予三位德國科學家,原因是三個人通力合作,在世界上首次解析了一種膜蛋白——菌光合反應中心的高分辨率三維結構,它拉開了膜蛋白結構生物學的序幕,在生物學界影響非常大。之后,科學家們在基因組學和蛋白質組學領域不斷取得新進展,可以作為潛在靶向藥物的蛋白質的數量呈指數級增加,然而這些方法獲得有用晶體的成功率不足20%。

藥物靶標G蛋白偶聯受體(GPCR)晶體

 

2011年,英國帝國理工學院和薩里大學的科學家們使用一種“分子印跡聚合物(MIPs)”的材料,研發出了一種更有效的制造蛋白質晶體的方法。但是這種方法在結晶條件成分復雜,包含高鹽,有機溶劑,寬泛的酸堿區間等條件下,容易造成MIPs對蛋白質的印記作用失效。科研不斷深入,技術不斷迭代,目前,應用最為廣泛的晶體制備方法當屬規模篩選,比如高通量蛋白質結晶篩選,即從成百上千個溶液條件中篩選出適合結晶的條件。據相關數據顯示,目前的高通量蛋白質結晶篩選的成功率僅為15.6%,嚴重制約了蛋白質結晶技術在結構生物學領域的應用和發展。缺乏高效、廣譜的蛋白晶體制備技術是目前結構生物學研究中的技術瓶頸。

近期,由中國科學院深圳先進技術研究院喻學鋒研究員課題組研發的一種蛋白質結晶篩選添加劑——人工晶種混懸液打破了技術桎梏。新法的應用,能夠讓蛋白質晶體的結晶更簡便,更科學,更完整。

03

先進院新技術提升蛋白質結晶成功率

100多年前,吉布斯等人提出“經典成核理論”,結晶過程是一些分子或原子偶然聚集在一起,碰巧以結晶形式排列,然后其他分子(原子)逐個附著,形成更大的結晶相,該結論得到了學術界廣泛認可。

然而,經典成核理論也有諸多缺點,它表明蛋白質晶體的成核并不是沿著經典路線而是更復雜的路線進行的,即兩步法成核理論。第一步是形成足夠尺寸的溶質分子團簇,第二步是團簇重新排列形成有序結構。目前的實驗和理論研究,證明了兩步法成核理論不僅可以應用到生物大分子(如蛋白質)上還用到了有機小分子上,表明這一機理或許會成為大部分溶液析晶過程的基礎。在液滴內從無序到有序結構團簇的形成,也就是第二步,決定晶體成核速率,由于這一步中分子復雜性增加,成核的時間變長,因為高度的構象靈活性,更復雜的分子形成最佳晶格結構會更困難。

經典成核理論與兩步成核理論中吉布斯自由能隨結晶過程的變化比較

 

傳統的成核劑材料,如礦物晶體、石墨烯、多孔材料如多孔硅等都曾作為成核劑用于蛋白質結晶實驗中,這些成核劑的設計主要依賴于經典的成核理論,無法適用于構象靈活性強的絕大多數蛋白質分子。針對這一難題,材料界面中心和武漢先進院團隊經過不斷的設計和實驗驗證,最終將成核劑材料設計為具有超構表面的材料。

超構材料21世紀初被提出,截至目前它仍然是非常活躍的前沿領域。其中的微結構,大小尺度與它作用的蛋白質尺寸相當,因此得以對蛋白質的結晶過程施加干預,對蛋白質的聚集態形成起到促進作用,從而降低了兩步成核中的第一步能壘。其次,通過材料本體結構的晶格對聚集態蛋白質分子進行引導排列,促進蛋白質分子的有序排列和晶核形成,從而降低了兩步成核中的第二步能壘。

成核劑誘導蛋白質結晶

 

盡管通過實驗和理論證明了超構材料在蛋白質結晶方面的巨大潛力,但要充分發揮其優勢則必須兼容當前蛋白質結晶通過的高通量篩選系統。目前國際上普遍采用液體處理機器人來進行高通量結晶篩選,篩選一個結晶條件的蛋白樣品消耗體積為納升級別。因此,如何快速,穩定地將成核劑添加到高通量系統的同時,又不對結晶系統造成大的影響成為急需解決的問題。

隨后通過優化生產和制備工藝,考察了各生產因素對成核劑尺寸和穩定性的影響,確定了適合高通量蛋白質結晶篩選的成核劑混懸劑的制備工藝流程。這是一種含有具有表面超結構的有機無機復合材料,其尺寸分布在幾百納米到幾微米之間。該產品的組成為材料顆粒與水溶液的混懸液。在蛋白質結晶篩選實驗中,使用該產品有助于提高蛋白質結晶篩選的成功率,包括改善晶體的分辨率和篩選新的結晶條件,使不結晶或難結晶的蛋白質成功結晶,展現了巨大的應用潛力,使用該成核劑已經成功結晶和解析十多個蛋白質晶體結構。

此外,針對能夠結晶的蛋白質分子,成核劑混懸液在篩選新的結晶條件,提升結晶的分辨率方面同樣有效。目前,先進院已經與國內超過18個實驗室開展了合作,助力我國的生命科學和生物醫藥研究。

采寫:李龍、李香君

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